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化學(xué)發(fā)光丨最具潛力的免疫學(xué)檢測(cè)方法

日期:2020-10-07

化學(xué)發(fā)光丨最具潛力的免疫學(xué)檢測(cè)方法


免疫學(xué)的檢測(cè)方法是實(shí)驗(yàn)室使用最普遍的檢測(cè)方法,從凝集試驗(yàn)、膠體金到ELISA,未來(lái)隨著檢測(cè)方法朝著高通量和自動(dòng)化的方向發(fā)展,化學(xué)發(fā)光方法將是大勢(shì)所趨!
概要:化學(xué)發(fā)光技術(shù)壁壘高的根本原因在于:1)被檢測(cè)物質(zhì)的濃度低(μg/L—pg/L ),造成對(duì)整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度要求高,儀器與試劑體系封閉;2)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程步驟多,自動(dòng)化難度大;3)包含生物、化學(xué)、物理、光學(xué)等各個(gè)學(xué)科的多種前沿技術(shù),缺一不可。
國(guó)內(nèi)外主流的試劑技術(shù)類(lèi)似,主流有直接化學(xué)發(fā)光(異魯米諾(新產(chǎn)業(yè))、吖啶酯(雅培))、間接(酶促)化學(xué)發(fā)光(丹納赫、邁瑞、安圖)、電化學(xué)(羅氏),各有優(yōu)劣勢(shì),暫無(wú)明顯技術(shù)替代的趨勢(shì),但是電化學(xué)發(fā)光被認(rèn)為是第三代技術(shù),技術(shù)上略略領(lǐng)先。
試劑的性能包括準(zhǔn)確度、靈敏度、線性范圍、抗干擾能力、存儲(chǔ)穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、試劑盒規(guī)格等;機(jī)器的性能包含檢測(cè)速度、試劑位、樣本位、儀器大小等,準(zhǔn)確度是核心,通過(guò)與已獲證產(chǎn)品的對(duì)比得到;其他性能間接影響準(zhǔn)確度,需要結(jié)合具體項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)、廠家性能以及客戶(hù)需求綜合評(píng)價(jià)。
化學(xué)發(fā)光是干什么的?化學(xué)發(fā)光臨床廣泛應(yīng)用于臨床。化學(xué)發(fā)光是免疫診斷的一種,是利用抗原抗體之間的特異性反應(yīng)來(lái)測(cè)定體內(nèi)疾病標(biāo)志物濃度,從而判斷人體身體狀態(tài)的診斷方法,廣泛應(yīng)用于傳染病、心臟疾病、腫瘤、妊娠檢測(cè)等。


免疫檢測(cè)標(biāo)志物統(tǒng)計(jì)超過(guò)100個(gè),按照免疫反應(yīng)中的角色,標(biāo)志物可以分為抗體與抗原,其中抗原又包括大分子抗原與小分子抗原。


化學(xué)發(fā)光的原理免疫反應(yīng)。抗原進(jìn)入機(jī)體,刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng),使之產(chǎn)生免疫應(yīng)答,這種反應(yīng)叫免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)應(yīng)答包括對(duì)抗原物質(zhì)的感應(yīng)、反應(yīng)、效應(yīng)三個(gè)連續(xù)的階段。免疫分析(immunoassay,IA)。在臨床檢驗(yàn)中,基于抗原與其配對(duì)抗體能夠發(fā)生特異反應(yīng),用已知的抗原或抗體檢測(cè)分析體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。高特異性。抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系,所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。抗原抗體反應(yīng)的高特異性是免疫學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)。高親和性。抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡,其反應(yīng)式為:Ag+Ab→Ag·Ab。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,兩者結(jié)合牢固,不易解離。
免疫分析技術(shù)的發(fā)展:美國(guó)臨床化學(xué)會(huì)議規(guī)定:凡是通過(guò)測(cè)量光子計(jì)數(shù)的方法都是化學(xué)發(fā)光。與酶聯(lián)免疫相比化學(xué)發(fā)光的進(jìn)步點(diǎn):1.全程自動(dòng)化——機(jī)械與自動(dòng)化;2.定量技術(shù)的優(yōu)化:利用化學(xué)發(fā)光發(fā)光,精確計(jì)算光子數(shù)——光學(xué);3.磁性顆粒的應(yīng)用——材料;4.抗體標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步——生物化學(xué)。

免疫診斷五大方法對(duì)比:化學(xué)發(fā)光是趨勢(shì)與其他免疫診斷方法相比,化學(xué)發(fā)光由于其在安全性、自動(dòng)化操作、測(cè)試準(zhǔn)確性、以及測(cè)試速度等方面的系統(tǒng)性?xún)?yōu)勢(shì),在性能上對(duì)其他技術(shù)形成全面超越,因此成為免疫診斷的主流。


化學(xué)發(fā)光步驟繁多。化學(xué)發(fā)光原理解析:以酶促法(一步法)為例

根據(jù)沖洗次數(shù),可以分為一步法、兩步法、三步法等、四步法;
各個(gè)組分的量在5~200uL級(jí)別;所有過(guò)程均需要在特定溫度中進(jìn)行;樣本中與被檢測(cè)檢測(cè)抗原/抗體結(jié)構(gòu)類(lèi)似的物質(zhì)會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響;


磁微粒標(biāo)記-分離技術(shù)

?磁微粒指的是nm級(jí)別的磁性顆粒,表面帶有活性基團(tuán);

磁微粒可以利用表面的活性基團(tuán)與抗體、抗原、鏈霉親和素連接;

伴隨著磁微粒技術(shù)的發(fā)展,板式發(fā)光已基本被替代。

?

磁微粒分離技術(shù)特點(diǎn):

?較微孔板擴(kuò)大抗原抗體結(jié)合表面積,增加抗原或抗體的結(jié)合量,提高檢測(cè)靈敏度。

?加快反應(yīng)速度,迅速捕獲抗原抗體。

?易于結(jié)合相、游離相的分離,提高檢測(cè)準(zhǔn)確性

酶標(biāo)記技術(shù)、溯源以及試劑盒的開(kāi)發(fā)難點(diǎn)酶標(biāo)記技術(shù)?抗體/抗原表面具有多個(gè)活化基團(tuán)(氨基/羧基),通過(guò)這些基團(tuán)連接酶與抗體稱(chēng)為酶標(biāo)記;?酶標(biāo)記分為大分子與大分子標(biāo)記、大分子與小分子標(biāo)記;?交聯(lián)程度的小大對(duì)試劑盒性能起重要影響。試劑盒的開(kāi)發(fā)?變量多:抗體對(duì)的配對(duì)、“磁珠”與“酶標(biāo)”的稀釋度、合適的“配方”溶液、其他的試劑盒組分、孵育時(shí)間檢測(cè)結(jié)果溯源?將開(kāi)發(fā)的試劑盒檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照結(jié)果建立相關(guān)的關(guān)系?標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性是難點(diǎn)?不同的廠家檢測(cè)結(jié)果的絕對(duì)值可能不同

主流的化學(xué)發(fā)光技術(shù)各有千秋化學(xué)發(fā)光的基本原理:由于化學(xué)反應(yīng)(通常是氧化)底物從基態(tài)躍遷為激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí),躍遷能量以光子形式釋放的現(xiàn)象。
吖啶酯、ALP以及HRP發(fā)光系統(tǒng)的原理電化學(xué)發(fā)光原理各個(gè)系統(tǒng)優(yōu)劣勢(shì)比較
主流的5大發(fā)光技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)??綜合來(lái)看,主流的5大發(fā)光技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn),不能說(shuō)技術(shù)誰(shuí)優(yōu)誰(shuí)劣,但是從市場(chǎng)來(lái)看,Roche的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)市場(chǎng)認(rèn)可度稍稍領(lǐng)先;?從國(guó)外四大家的優(yōu)勢(shì)項(xiàng)目對(duì)比來(lái)看,Roche(電化學(xué))在腫瘤項(xiàng)目上占優(yōu),雅培(吖啶酯)在傳染病項(xiàng)目上占優(yōu),而丹納赫(ALP)在甲功激素項(xiàng)目上占優(yōu),也可以看出代表各個(gè)國(guó)外龍頭廠家代表的技術(shù)無(wú)法占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì);?相對(duì)于不同技術(shù)種類(lèi)的差異,國(guó)內(nèi)廠家對(duì)產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制能力更為重要。
化學(xué)發(fā)光試劑的性能評(píng)價(jià)與比較:?準(zhǔn)確度是評(píng)價(jià)試劑性能的主要指標(biāo),一切指標(biāo)都體現(xiàn)在測(cè)試是否準(zhǔn)確,但是由于各個(gè)標(biāo)志物均有一定的特異性,客戶(hù)無(wú)法根據(jù)某一次結(jié)果的正確與否對(duì)該廠家的產(chǎn)品做出評(píng)價(jià)——化學(xué)發(fā)光的結(jié)果只能作為參考,不能作為金標(biāo)準(zhǔn);?國(guó)內(nèi)廠家結(jié)果的準(zhǔn)確度根據(jù)與國(guó)外廠家的對(duì)比結(jié)果來(lái)判斷,線性系數(shù)R2、顯著性水平等是重要的指標(biāo);?除了準(zhǔn)確度以外,試劑的靈敏度、重復(fù)性、線性范圍、抗干擾能力、存儲(chǔ)穩(wěn)定性、開(kāi)機(jī)穩(wěn)定性、試劑盒的包裝量等20多個(gè)參數(shù)均為試劑盒的評(píng)價(jià)指標(biāo)。除了儀器與試劑性能的對(duì)比,裝機(jī)量、單機(jī)使用量、項(xiàng)目總數(shù)量、項(xiàng)目發(fā)布、三甲醫(yī)院使用率等數(shù)據(jù)對(duì)評(píng)價(jià)廠家的產(chǎn)品同樣重要,需要綜合評(píng)價(jià)。
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